Robert Picardo wurde in Philadelphia, Pennsylvania geboren, wo er auch seine ganze Kindheit verbrachte. Er schluss die William Penn Charter Schule ab und ging dann an die Yale University. In Yale bekam er eine Rolle in Leonard Bernstein's "Mass" und im Alter von 19, spielte er eine Hauptrolle in der Europapremiere von "Mass". Später schluss er dann die Yale University erfolgreich ab. Sein großes Depüt gab er in dem David Mamet Stück "Sexual Perversity" und mit Diane Keaton in "The Primary English Class." Danach folgten erste Filmauftritte und die Karriere entwickelte sich langsam.

Seinen endgültigen und vor allem internationalen Durchbruch hatte Picardo durch die Rolle des anfänglich namenlosen Doktors aus Star Trek: Raumschiff Voyager. Als "Medizinisch-holographisches Notfallprogramm" (MHN) war er auch im Kinofilm Star Trek: Der erste Kontakt zu sehen.
In Star Trek: Deep Space Nine hatte er einen Gastauftritt als Lewis Zimmerman, dem Erfinder des Holographischen Doktors. In derselben Folge spielte Picardo ebenfalls ein MHN.